Dalam kedua-dua proses penetapan rendaman dan perfusi, bahan fiksatif kimia digunakan untuk mengekalkan struktur dalam keadaan (dari segi sifat kimia dan struktur) sedekat mungkin dengan tisu hidup. Hal ini memerlukan fiksatif kimia.

Fiksatif penghubung silang – aldehid

Fiksatif penghubung silang bertindak dengan mencipta ikatan kimia kovalen antara protein pada tisu. Hal ini menambat protein larut pada sitoskeleton, dan memberikan ketegaran tambahan pada tisu. Pemeliharaan struktur sitoskeleton sementara atau halus seperti pengecutan semasa gelombang pembezaan embrio boleh dilakukan terbaik menggunakan kaedah prarawatan menggunakan gelombang mikro sebelum penambahan fiksatif penghubung silang.[11][12]

Fiksatif yang paling biasa digunakan dalam histologi ialah formaldehid. Ia biasanya digunakan sebagai 10% formalin tertimbal neutral (NBF), iaitu lebih kurang 3.7%–4.0% formaldehid dalam penimbal fosfat, pH 7. Memandangkan formaldehid ialah gas pada suhu bilik, formalin–gas formaldehid terlarut dalam air (~37% w/v) – digunakan semasa membuat fiksatif tersebut. Formaldehid membetulkan tisu dengan menghubungkan silang protein, terutamanya sisa-sisa asid amino asas lisin. Kesannya boleh diterbalikkan dengan air berlebihan dan ia mengelakkan pigmentasi formalin. Paraformaldehid juga biasa digunakan dan akan menyahpolimer semula menjadi formalin apabila dipanaskan, juga menjadikannya fiksatif yang berkesan. Faedah lain penggunaan paraformaldehid termasuklah penyimpanan jangka panjang dan penembusan tisu yang baik. Ia amat baik untuk teknik imunohistokimia. Wap formaldehid juga boleh digunakan sebagai fiksatif untuk calitan sel.

Satu lagi aldehid yang popular untuk penetapan ialah glutaraldehid. Ia beroperasi sama seperti formaldehid, menyebabkan pencanggaan protein heliks-α. Walau bagaimanapun glutaraldehid adalah molekul yang lebih besar berbanding formaldehid, maka meresap ke dalam membran lebih perlahan. Akibatnya, penetapan glutaraldehid pada sampel tisu yang lebih tebal boleh menjadi sukar; tetapi masalah ini boleh diatasi dengan mengurangkan saiz sampel tisu. Salah satu kelebihan penetapan glutaraldehid ialah ia mungkin menawarkan produk penetapan yang lebih tegar atau berhubung kait dengan lebih ketat, kerana panjangnya yang lebih besar dan dua kumpulan aldehid membolehkannya 'merapat' dan menghubungkan pasangan molekul protein yang lebih jauh. Glutaraldehid boleh menyebabkan perubahan yang cepat dan tidak dapat dipulihkan, sangat sesuai untuk teknik mikroskop elektron, berfungsi dengan baik pada 4 °C, dan memberikan perincian keseluruhan sitoplasma dan nukleus yang terbaik. Walau bagaimanapun, ia tidak sesuai untuk pewarnaan imunohistokimia.

Sesetengah protokol penetapan memerlukan gabungan formaldehid dan glutaraldehid supaya kekuatan masing-masing saling melengkapi.

Fiksatif penghubung silang ini, terutamanya formaldehid, cenderung untuk mengekalkan struktur sekunder protein dan juga boleh mengekalkan kebanyakan struktur tertier.

Fiksatif mendakan – alkohol

Fiksatif pemendakan (atau denaturasi) bertindak dengan mengurangkan keterlarutan molekul protein dan selalunya melalui cara penggangguan interaksi hidrofobik yang terlibat dalam pemberian banyak struktur tertier protein tersebut. Pemendakan dan pengagregatan protein adalah proses yang sangat berbeza berbanding proses penghubung silang yang berlaku dengan fiksatif aldehid.

Fiksatif pemendakan yang paling biasa digunakan ialah etanol dan metanol. Ia biasanya digunakan untuk membaiki bahagian beku dan calitan. Aseton juga digunakan dan telah terbukti menghasilkan pemeliharaan histologi yang lebih baik berbanding penghirisan beku apabila digunakan pada teknik Acetone Methylbenzoate Xylene (AMEX).

Metanol, etanol dan aseton penyahasli protein jarang digunakan secara bersendirian untuk menetapkan blok melainkan mengkaji asid nukleik.

Asid asetik ialah penyahasli yang kadangkala digunakan dalam kombinasi dengan fiksatif pemendakan lain, seperti AFA Davidson.[13] Alkohol, dengan sendirinya, diketahui menyebabkan pengecutan dan pengerasan tisu yang ketara semasa proses penetapan manakala asid asetik semata-mata dikaitkan dengan pembengkakan tisu; maka penggabungan kedua-dua bahan ini boleh menghasilkan pemeliharaan morfologi tisu yang lebih baik.

Agen pengoksidaan

Fiksatif pengoksidaan boleh bertindak balas dengan rantai sampingan protein dan biomolekul lain, membolehkan pembentukan pautan silang yang menstabilkan struktur tisu. Walau bagaimanapun, ia menyebabkan penyahaslian yang meluas walaupun dapat mengekalkan struktur halus sel dan digunakan terutamanya sebagai fiksatif sekunder.

Osmium tetroksida sering digunakan sebagai fiksatif sekunder apabila sampel disediakan untuk mikroskop elektron. (Ia tidak digunakan untuk mikroskop cahaya kerana ia menembusi bahagian tebal tisu dengan sangat teruk).

Kalium dikromat, asid kromik, dan kalium permanganat semuanya didapati digunakan dalam sediaan histologi tertentu.

Larutan bermerkuri

Larutan bermerkuri seperti B-5 dan fiksatif Zenker mempunyai mekanisme yang tidak diketahui yang meningkatkan kecerahan pewarnaan dan memberikan butiran nukleus yang sangat baik. Walaupun cepat, merkuri menembusi dengan cara yang buruk dan menghasilkan pengecutan tisu. Aplikasi terbaik larutan ini adalah untuk penetapan tisu hematopoietik dan retikuloendotelial. Perlu diambil perhatian bahawa disebabkan ia mengandungi merkuri, langkah berjaga-jaga mesti diambil sewaktu pelupusan.

Pikrat

Pikrat menembusi tisu dengan baik untuk bertindak balas dengan histon dan protein asas untuk membentuk pikrat berhablur dengan asid amino dan memendapkan semua protein. Ia adalah fiksatif yang baik untuk tisu penghubung, memelihara glikogen dengan baik, dan mengekstrak lipid untuk memberikan hasil yang lebih baik berbanding formaldehid dalam proses pewarnaan imuno bagi hormon-hormon biogenik dan polipeptida. Walau bagaimanapun, ia menyebabkan kehilangan basofil melainkan spesimen dibasuh dengan teliti selepas penetapan.

Kesan perlindungan pelarut organik yang dimediasi penimbal hepes-asid glutamik (HOPE) memberikan morfologi seakan formalin, pemeliharaan antigen protein yang sangat baik untuk imunohistokimia dan histokimia enzim, hasil RNA dan DNA yang baik serta ketiadaan protein penghubung silang.